lunes, 18 de junio de 2012

Extraccion del ADN del tejido epitelial

Extracción del ADN del tejido epitelial humano Responsables: Francis Crevoisier Cristina Lalinde Sonia Rapsch Rolf Wirthlin Centro: Colegio Suizo de Madrid Fuente: VII Feria Madrid por la Ciencia Dirigido a: ESO y Bachillerato Material Sal común (1,5 g). Bicarbonato de sodio (5 g). Agua mineral (120 mL). Lavavajillas (5 mL). Saliva de la boca (2 mL, aproximadamente). 15 mL de alcohol etílico 96°. Fundamento científico La saliva arrastra las células del epitelio que recubre las paredes internas de la boca y que se están desprendiendo constantemente. La sal común (NaCl), con esa concentración, es un medio hipertónico que provoca el estallido de las células y los núcleos, quedando libre las fibras de cromatina. El detergente cumple la misión de formar un complejo con las proteínas histonas y separarlas del ADN. Desarrollo 1. Cada participante recibe un pequeño frasco de cristal. En él deposita 15 mL de tampón frío que ha pipeteado. 2. A continuación escupe unas siete veces en el interior del frasco, teniendo la precaución de no haber ingerido alimento alguno en los 15 minutos previos. 3. Mueve ligeramente el frasco para que se mezclen bien. 4. Pipetea 15 mL de alcohol de 96° frío y lo deja caer resbalando por las paredes del frasco. En la interfase agua-alcohol se empiezan a visualizar inmediatamente unas fibras blanquecinas que son las moléculas de ADN. Como complemento, se pueden recoger estas fibras con una varilla de cristal y teñirlas con azul de metileno para observarlo al microscopio óptico. Objetivo En esta práctica realizaremos la extracción del ADN de las células de descamación del epitelio mucoso del interior de la boca, poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que permite el empaquetamiento en el núcleo celular de las larguísimas cadenas de esta molécula. Tras la extracción se suspenderá el ADN recuperado en alcohol de 70º para su conservación. Material necesario - Agua mineral - Alcohol de 96º muy frío - Cucharillas de plástico - Palillo o varilla de vidrio - Sal común - Detergente lavavajillas - Vasos desechables - Tubo de ensayo - Gradilla - Tubos eppendorf - Alcohol de 70º Fundamento El ADN se encuentra en el interior del núcleo de todas las células, disperso y muy replegado, unido a proteínas para formar la cromatina. Por lo tanto, podremos extraerlo a partir de prácticamente cualquier material de origen biológico. Para ello es necesario romper las células para separar el núcleo y romper éste para liberar el ADN, separarlo de las proteínas y precipitarlo para separarlo de la solución acuosa. El ADN (y también algo de ARN) aparecerá entonces como un agregado de fibras blanquecinas de aspecto mucoso que se adhieren a una varilla de vidrio o a la pipeta. Podemos añadir unas gotas de azul de metileno o verde de metilo al tubo para teñirlo. Por último, se puede situar sobre un porta, teñirlo de la misma manera y observarlo al microscopio. También se puede conservar dejándolo secar sobre papel de filtro o suspendido en alcohol al 50% o 70%. Procedimiento 1. Preparar un tubo de ensayo con alcohol etílico de 96 ºpor cada alumno y poner a enfriar lo máximo que sea posible,por ejemplo en baño de agua con hielo, mientras se realizan los pasos siguientes. 2. Poner un poco de agua en un vaso y enjuagarse la boca enérgicamente durante al menos medio minuto para arrastrar el mayor número posible de células de descamación de la mucosa bucal (antes de hacerlo conviene haber tragado saliva para eliminar la acción de los enzimas contenidos en ella). 3. Mientras tanto pondremos una pequeña cantidad de agua destilada (o mineral) en el mismo vaso, unos 20ml, y añadimos dos pizcas de sal común y un par de gotas de detergente lavavajillas. 4. Expulsar el agua en el vaso de precipitados sobre la solución anterior. Dejaremos actuar durante unos 10 minutos, removiendo de vez en cuando suavemente para disolver estos componentes evitando la formación de espuma. 5. A continuación, añadir la solución suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol muy frío dejándola resbalar por la pared del tubo inclinado. El filtrado, más denso que el alcohol y algo turbio, se deposita en el fondo del tubo. Dejar reposar durante 2 ó 3 minutos sin moverlo en absoluto. El alcohol formará un sobrenadante por encima de la fase acuosa, en la que se encuentra el ADN en disolución, provocando que éste precipite.. 6. Esperar unos minutos mientras el ADN precipita en la interfase alcohol-agua formando una masa blanquecina que asciende lentamente formando un grumo de aspecto algodonoso. 7. Tras unos minutos de reposo, el ADN tiende a subir hacia la superficie del alcohol. 8. Entonces podremos recogerlo utilizando una varilla de vidrio, una pipeta Pasteur o simplemente un palillo. Para ello, se introduce en la masa de ADN y se extrae suavemente mientras se hace girar entre los dedos. 9. Entretanto habremos preparado los tubos eppendorf con alcohol de 70º para la conservación del ADN. 10 .Una vez extraído el ADN podemos suspenderlo en el tubo eppendorf u otro recipiente adecuado para su conservación.

Extraccion de ADN del higado de pollo

Extracción de ADN del hígado de pollo Materiales: • Trocitos de hígado de pollo • Solución de NaCl 2M • Detergente líquido para vajilla • Alcohol etílico 96° • Mortero • Embudo • Varilla de vidrio • Dos vasos de precipitado de 250 cm3 • Un trozo de gasa • Gotero • Portaobjetos y cubreobjetos • Microscopio Óptico Objetivos: • Extraer o aislar ADN en cantidad suficiente para que lo podamos reconocer a simple vista • Diseñar un póster para exponer la experiencia. Procedimiento: 1. Reúnan en la mesa de laboratorio, todos los materiales indicados. 2. Trituren en un mortero trocitos de hígado de pollo en 50 cm3 de agua de la canilla. Con este procedimiento, logran romper la membrana plasmática y liberar el núcleo de cada una de las células del hígado empleado. 3. Filtren varias veces usando un trozo de gasa de trama cerrada. De esta forma, se separan los restos de tejidos que no lograron desprender sus núcleos. 4. Si obtuvieron 100 ml del filtrado por el procedimiento anterior, agreguen el mismo volumen, es decir 100 ml, de una solución de NaCl 2M. 5. Al colocar el filtrado en una solución salina, se provoca la ruptura de la membrana nuclear, y, de esta manera, la cromatina queda libre. A continuación, agreguen 1 cm3 de detergente de vajilla. Su acción permite que se desarmen las bicapas lipídicas que forman las membranas de los organoides celulares y que se desprendan las proteínas que acompañan la estructura del ADN. 6. Agreguen alcohol con la pipeta. Traten de que el alcohol se deslice suavemente por las paredes del vaso de precipitado. Presten atención y vean a la luz levantando el vaso. En él, podrán observar dos fases o capas definidas. Entre ambas, reconocerán el ADN. 7. Introduzcan la varilla de vidrio y revuelvan siempre en la misma dirección durante unos minutos. 8. Verán a simple vista cómo se adhieren finas fibras blancas sobre la varilla de vidrio. 9. Con la ayuda de la varilla de vidrio, retiren algunas de esas fibras; apóyenlas en un portaobjetos y obsérvenlas al microscopio óptico.